Struktuur en interaktie analyse van NAD+ en NAD+ analoga in horse liver alcohol dehydrogenase

Dit verslag beschrijft een studie naar de relatie tussen struktuur en funktie voor het co-enzym NAn+ en zijn analoga in de aktieve holte van het enzym Horse Liver Alcohol Dehydrogenase (LADH). De rol van NAD+ in enzymgekatalyseerde oxidatie-reduktie reakties is die van het bewerkstelligen van een reversibele en stereoselektieve waterstofoverdracht tussen co-enzym en substraat. Testen van binding en aktiviteit van NAD+ analoga is een goede methode om meer inzicht te verkrijgen over de orientatie van het co-enzym binnen het ternaire komplex enzym/co-enzym/substraat en de interakties die van betekenis zijn voor het stereochemische verloop van deze waterstofoverdracht. De stereospecificiteit wordt enerzijds veroorzaakt door eenzijdige afscherming van het enzym, anderzijds door de positie die de pyridine carbonylgroep van het NAD+ inneemt zodra een komplex met het enzym is gevormd. Het onderzoek heeft zich gericht naar de invloed van de substituenten aan de pyridinering, maar daarnaast ook naar de invloed van de orientatie van de pyridine carbonylgroep (CO dipool). Molekulaire mechanica (AMBER) berekeningen werden gebruikt om de geometrie van NAD+ en NAD+ derivaten te simuleren in het aktieve centrum van het ternaire komplex met LADH en DMSO. De resultaten 1aten zien dat AMBER een bruikbaar programma is voor de evaluering van de essentiele interakties die bepalend zijn voor de geometrie van het NAD+ in de aktieve holte. De rekenmethode kan eveneens voorzien in informatie die kan worden toegevoegd aan data verkregen uit X-ray kristallografische studies. Berekeningen aan NAD+ analoga gemodificeerd in hun nicotinamide groep, tonen aan dat hun positionering sterk beinvloed wordt door het aanbrengen van substituenten aan de pyridinering. De studie geeft een nieuwe benadering in het bepalen van de geometrie van het co-enzym analogon onafhankelijk van de beschikbaarheid van additionele X-ray data. Echter, de beschreven rekenmethode kan niet worden ontwikkeld om de exacte geometrie van de NAD+ analoga te bepalen. De aktiviteit van een aantal NAD+ analoga waaraan de berekeningen zijn uitgevoerd, zijn experimenteel bepaald via kinetisch-enzymatische studies. Deze enzymatische experimenten ondersteunen het AMBER model en laten zien dat de reaktiviteit van NAD+ derivaten kwalitatief kan worden gerelateerd aan de berekende positie van het pyridinegedeelte in de aktieve holte. (Naast de belangrijkste faktor geometrie moet echter oak rekening worden gehouden met de intrinsieke reaktiviteit, de redoxpotentiaal en de CO-rotatievrijheid.) Het onderzoek laat oak toe dat m.b.v. molekulaire mechanica berekeningen mogelijkheden kunnen worden geselekteerd voor aminozuursubstitutie binnen het enzym (site-directed mutagenese), wat kan leiden tot verhoging van de aktiviteit van NAD+ analoga.